Desenvolvimento e otimizaÃÃo de mÃtodos de Biologia Molecular para o diagnÃstico de Leishimania chagasi e Helicobacter pylori

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DATA DE PUBLICAÇÃO

2006

RESUMO

Neste trabalho foram desenvolvidos e otimizados mÃtodos diagnÃsticos para dois agentes patogÃnicos com uma alta incidÃncia no Brasil e cujos diagnÃsticos se baseiam principalmente em mÃtodos invasivos como sÃo o Helicobacter pylori e Leishmania chagasi (L. chagasi). A bactÃria gram (-) Helicobacter pylori e a principal causa de ulcera pÃptica e gastrite maligna no mundo. Seu diagnostico e realizado preferencialmente por meio de endoscopia e biopsia de tecido gÃstrico. A bactÃria e eliminada pelas fezes o que permitiria um diagnostico nÃo invasivo e de controle de cura se implementar PCR de amostras de pacientes antes e durante o tratamento de doenÃa. NÃo entanto as fezes possuem uma serie de inibidores o que tem dificultado o desenvolvimento de mÃtodos de PCR para seu diagnostico. Aqui comparamos mÃtodos de obtenÃÃo de DNA de fezes baseados em fervura das amostras descritos anteriormente por Holland (2000), com mÃtodo de Lise Alcalina , modificado com o uso de Triton X-100 melhorando a obtenÃÃo de DNA eliminando a presencia de inibidores. Posteriormente DNAs provenientes de amostras de fezes de 10 pacientes foram utilizados em reaÃÃes de PCR com alvos especÃficos descritos anteriormente para Helicobacter pylori (urec, RNAr e vac); 5 das amostras amplificaram de maneira especifica concordando com o diagnostico Giemsa (+) de biopsia de tecido gÃstrico de pacientes com dispepsia. L. chagasi, protozoÃrio responsÃvel de causar a leishmanioses visceral, no Brasil apresenta uma alta incidÃncia e ampla distribuiÃÃo, com formas graves e letais quando associada a quadros de ma nutriÃÃo e infecÃÃes concomitantes. O diagnostico e realizado principalmente por punÃÃo aspirativa de baÃo, fÃgado, medula Ãssea ou linfonodos permitindo a visualizaÃÃo do parasita no material. No presente trabalho desenvolvemos PCR simples usando diferentes DNAs parasitÃrios de tripanosomatideos e oligonucleotideos PIA 3 e DEB 8 especÃficos para L. chagasi.. Os dois pares de oligonucleotideos resultaram serem especÃficos para L.chagasi, sendo a sensibilidade de 10 pg para PIA3 e de 1 pg para DEB8. Com o objetivo de diferenciar o diagnostico de Leishmaniose visceral e Leishmanioses tegumentar foi desenvolvida PCR mÃltipla utilizando alvos especÃficos para leishmania subgÃnero Viannia, denominados LV1 junto com os alvos especÃficos para L. chagasi . Os 4 oligonucleotideos nÃo competeram entre sim na reaÃÃo e mantiveram a especificidade e sensibilidade das PCR simples. Posteriormente um analise de bioinformÃtica dos bancos de dados dos genes de Tripanosomatideos do portal GeneDB do Sanger Centre foi realizado na procura de um gene ÃrfÃo de L. infantum para ser usado no diagnostico de L chagasi. 7.078 proteinas hipotÃticas de L. infantum, foram comparados com 11.812 de T cruzi, 7557 de T brucei e 5.364 de L major. AtravÃs das ferramentas omni blast e Protogim, conseguimos seleccionar 93 proteinas hipotÃticas de L infantum. Por critÃrios de tamanho, localizaÃÃo celular e outros, 5 putativos alvos foram escolhidos para serem testados in vitro. O gene Linj 20074, resultou ser altamente especifico e com sensibilidade de 1pg. Genes ÃrfÃos se apresentam como promissores alternativas para diagnostico ou alvo quimioterapicos em doenÃas parasitarias

ASSUNTO(S)

biologia molecular helicobacter pylori leishmania chagasi molecular biology diagnostic helicobacter pylori leishmania chagasi ciencias biologicas diagnÃstico

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