Screening and functional analysis of genes regulated by MT Polyoma Virus antigen in the malign transformation of Balb-3T3 cell line / Busca e identificação de genes regulados pelo Antígeno MT do vírus Polioma na transformação maligna de células Balb-3T3

AUTOR(ES)
DATA DE PUBLICAÇÃO

2007

RESUMO

O Vírus Polioma (Py), induz a formação de múltiplos tumores em camundongos, e causa transformação maligna em cultura, levando à menor dependência de soro e ancoragem para crescimento. Dentre as proteínas codificadas pelo vírus polioma, o antígeno MT (Middle T), isoladamente, é capaz de transformar linhagens celulares imortalizadas e gerar tumores quando injetadas em camundongos, sendo que este caráter transformante está relacionado à sua capacidade de se ligar e modular a atividade de diversas proteínas, muitas das quais relacionadas com o controle do ciclo celular. Para melhor compreender os mecanismos moleculares da transformação maligna mediada por MT e do controle do ciclo celular, o objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar novas vias de transdução de sinal e novos genes regulados por MT. Para a busca de genes regulados pela atividade de MT, comparou- se o perfil da expressão gênica da linhagem que expressa MT (MTWT) com o da linhagem controle (PLJ) através de três metodologias: membranas de nylon comerciais (Atlas Mouse Cancer 1.2 - Clontech), bibliotecas subtrativas de cDNA construídas através da técnica de RDA (Análise de Diferença Representacional) e lâminas comercias de microarrays (CodeLink Bioarrays - GE Healthcare). As três metodologias permitiram a identificação de cerca de 1.200 genes-candidatos a serem regulados por MT, dos quais 84 genes foram selecionados para terem sua expressão diferencial analisada por Real-Time PCR. Para identificar possíveis vias de transdução de sinal relacionadas à regulação dos genes analisados utilizou-se, como template, além do cDNA proveniente das linhagens PLJ e MTWT, cDNAs de linhagens que expressam a proteína MT mutada nas tirosinas 315, 322, 250 e 315/322. Após confirmação por Real-Time PCR, dois genes foram selecionados para analise funcional: Dlk1 (Delta Like-1 homolog) que, apesar de não ter relação direta com o controle do ciclo celular, está ligado à formação de alguns tumores, e MN1 (Meningioma 1), um gene pouco caracterizado que já foi relacionado à formação de leucemias mielóides e meningiomas. - I - RESUMO Para caracterizar o papel de MN1 na linhagem PLJ, foram geradas linhagens PLJ que superexpressam RNAi de MN1. A análise dos parâmetros de crescimento, em substrato sólido e semi-sólido, da linhagem PLJ parental e PLJ expressando o RNAi de MN1 não apresentou alterações estatisticamente significativas. Para o estudo do efeito de Dlk1 na transformação mediada por MT, foram geradas linhagens MTWT que superexpressam Dlk1, o que levou a um aumento estatisticamente significativo na taxa de divisão celular, quando comparada com a linhagem controle (vetor vazio), indicando um possível papel de Dlk1 no sinal desencadeado por MT e no controle do ciclo celular. Visando identificar novas vias de regulação entre os genes analisados, os níveis de expressão gênica dos demais genes foram avaliados por Real-Time PCR e analisados através de correlação de Pearson, aplicada a cada par de genes. Após a análise, foram identificadas 64 possíveis vias de regulação, sendo que 13 destas foram descritas pela primeira vez no presente trabalho e as demais, por já estarem descritas na literatura, permitiram validar o modelo estudado.

ASSUNTO(S)

câncer codelink bioarrays vírus polioma mt antigen regulação gênica regulação neoplásica da expressão gênica antígeno mt cell cycle control rda poliomavirus codelink bioarrays signaling pathways controle do ciclo celular vírus oncogênicos rda

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